1.研究目的

研究捻转血矛线虫感染山羊后Toll样受体变化规律，了解捻转血矛线虫-宿主相互作用，为捻转血矛线虫病的免疫预防和药物治疗提供新的思路。

2.研究内容

研究捻转血矛线虫感染山羊后宿主TOLL样受体的变化情况。

（1）将不同感染量的捻转血矛线虫L3感染空白山羊

用捻转血矛线虫第三期幼虫感染山羊（分高、中、低3个感染量）

（2）分别于不同时间采集感染后的山羊血液

（3）分离血液PBMC，分别提取总RNA 和总蛋白

（4）检测山羊TOLL样（TLR）受体家族成员动态变化

根据山羊各种模式识别受体和内参（actin）基因序列，设计特异性引物，用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测各种 TLR 基因转录水平，分析其动态变化。用 Western blot 方法检测各 TLR表达情况，通过与内参蛋白（ACTIN） 比较，进行相对量分析。

3.国内外研究现状和发展动态

（1）捻转血矛线虫病概况

捻转血矛线虫在我国广泛分布，主要寄生在反刍动物的真胃和十二指肠内。羊捻转血矛线虫病是在羊真胃中的一种寄生虫疾病。捻转血矛线虫的生长发育阶段不需要中间宿主的参与，仅有终末宿主，生活史包括自由生活和寄生生活两个阶段。它会产生大量虫卵，且虫卵具有很强的侵染力，每条雌虫每天排卵数量可以达到 5000~10000 个，通过粪便排出体外。在适宜的温度和湿度条件下，虫卵的生长发育特别快，在 1~2d 就会转变成第一期幼虫，随后经过 7d的生长发育会蜕变成第三期幼虫，第三期幼虫有很强的侵染力，羊对这种寄生虫的感染力最强^[1]。羊在饮用水或饲料中容易感染第三期幼虫。当羊被感染捻转血矛线虫后，虫体会通过吸附在羊的真胃壁黏膜上来吸取血液而获得营养，而且当虫体离开羊的真胃壁后，感染羊真胃内仍然还会持续性流血，极有可能会诱发继发感染并导致炎症。最终可能导致病羊出现渐进性贫血，这样会造成病羊机体发生故障。捻转血矛线虫主要寄生于羊皱胃的胃壁黏膜上，当若干条成虫寄生在胃肠黏膜时，胃肠组织的完整性就会遭到破坏，导致羊出现贫血症状。此外，捻转血矛线虫分泌一种影响羊的正常造血功能、抑制神经系统的毒素，最终可能导致羊吸收和消化功能紊乱，从而阻碍羊的生长发育^[2]。

随着国家重点基础研究发展计划（973计划）项目“牛羊重要寄生虫致病机制的分子基础”（项目编号：2015CB150300）的顺利开展，捻转血矛线虫感染与致病分子机制的研究取得了重要阶段性成果。目前已鉴定并研究了捻转血矛线虫TGF-β信号通路重要基因，通过RNAi或抑制剂方法发现这些基因能显著影响捻转血矛线虫在体外从脱鞘三期到四期的生长发育过程^[3]。感染的捻转血矛线虫三期幼虫具有耐干燥的特性，mRNA差异显示技术筛选了干燥环境中虫体的差异表达基因，RNAi实验确定了Hc-ubq和Hc-gst在线虫耐干燥中起重要作用^[4]。同样，用mRNA差异显示技术比较正常幼虫和四期早期滞育幼虫的差异表达基因，鉴定出Hc-fau影响虫体的寿命和繁殖^[5]。在捻转血矛线虫三期和四期虫体转录组学研究的基础上，筛选出一些线虫蜕皮相关基因和凝集素相关基因，其中Hc-clec-60基因影响虫体的大小和繁殖^[6]。用双向差异荧光凝胶电泳技术分析不同发育时期捻转血矛线虫的差异表达蛋白^[7]，筛选出多个与生长发育相关的关键酶分子，其中天冬氨酸蛋白酶抑制剂能显著抑制胃蛋白酶活性，可能参与调节宿主的免疫应答^[8]。精氨酸激酶（rHc -AK）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（serinethreonine phosphotase，STP）作为重要的排泄分泌（excretory-secretory antigens，ES）蛋白，参与宿主免疫反应，并在与山羊外周血单核细胞（peripheralblood mononuclear cells，PBMCs）相互作用过程中表现出明显的免疫调节特性，可作为控制感染的潜在分子靶点^[9-11]。另外还鉴定了脂肪酸代谢酶相关基因Hc-daf-22和Hc-maoc-1，研究发现它们与脂肪的储存和虫体寿命有关^[12-13]。研究建立的离体绵羊皱胃模型，可以模拟捻转血矛线虫早期感染对皱胃组织的影响，为捻转血矛线虫感染机制及与宿主相互作用的研究提供有效的体外模型^[14]。关于捻转血矛线虫感染与致病机制的研究还在不断的深入进行中，这些研究结果将为未来开发抗捻转血矛线虫病新型药物和疫苗奠定坚实基础，为建立新的防控策略做出重要贡献。^[15]

（2）Toll样受体研究进展

TLRs 是固有免疫中重要的模式识别受体，识别共生菌并维持肠道内环境稳态；致病菌入侵肠道激活TLRs信号通路诱发炎症反应^[16]。TLR1、TLR2、TLR4～6 和TLR10可识别细菌表面相关的分子模式，TLR3、TLR7～9可识别病毒和细菌的核酸^[17]。由于细菌多样性在整个肠道中分布各异，其数量可能代表细菌配体的变化，不同的细菌配体在调节 TLRs 表达和固有黏膜免疫反应中起重要作用^[18]。 当致病菌入侵肠道时，一旦突破了肠道黏膜屏障，就会被TLRs识别，TLRs与致病菌或病毒激动剂结合后，通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）途径诱导信号传导，引起促炎细胞因子和趋化因子以及宿主防御肽的释放，进而激活免疫细胞反应，发挥直接或间接杀菌作用^[19]。研究报道，TLR2 突变会增加奶牛对MAP的易感性，且在MAP感染的绵羊小肠中发现TLR6的表达上调，表明TLR2和TLR6在宿主对MAP的免疫应答中起重要作用，直接影响机体肠道健康^[20]。牛肠上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）在营养吸收和免疫屏障调节中具有重要作用，其IEC原代细胞培养是研究益生菌对牛宿主影响的理想模型^[21]。Chiba等^[22]在验证牛IEC作为研究抗病毒反应的模型系统的研究中，证实了TLR3的表达。此外，牛IEC对TLR3激动剂聚肌胞苷酸［poly（I：C），PIC］的刺激有较强的反应，并涉及到促炎细胞因子和Ⅰ型干扰素的显著上调，上述反应与牛和其他宿主的各类肠道病毒感染一致。Takanashi等^[23]在评估TLR4在牛IEC中的表达对热稳定性肠毒性大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC） 的响应的过程中，观察到TLR4对病原体相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMP）的识别表现为丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）和核转录因子－κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）途径的激活和细胞因子的产生。体外试验表明，移除3周龄犊牛回肠中的共生菌群后，TLR5和TLR6的表达显著上调，表明共生菌群可能在调节宿主相关TLRs表达方面发挥作用^[24]。Jiao等^[25]对山羊的研究同样表明结肠中普氏菌属、瘤胃球菌属与TLR2信号通路相关；颤螺菌属（Oscillospira）相对丰度与TLR2和TLR4基因表达之间的正相关关系表明其可能参与宿主免疫成熟过程，但具体功能尚不清晰。因此，TLRs通过识别PAMP激活信号通路，诱导促炎细胞因子表达，且不同的细菌配体在调节TLRs表达和固有黏膜免疫反应中起重要作用。^[26]

（3）寄生虫感染与先天免疫

近十多年报道的寄生虫感染主要涉及线虫、吸虫、绦虫、球虫等，且逐渐发现越来越多的抗药性产生。目前，家畜寄生虫病的预防主要采取化学驱虫、消灭中间宿主、切断传播媒介等措施，以及疫苗、治疗主要以化学药物治疗为主，营养治疗为辅。但常常存在消毒不彻底、药物治疗效果不佳、消毒和治疗成本制约等问题，特别是抗药性的产生与寄生虫的反复发作有直接关系。国内外已发现多种寄生虫产生了抗药性，如疟原虫、利什曼原虫、非洲锥虫和家畜的寄生线虫等^[27-28]。寄生虫对治疗药物产生抗性的过程，实际上是原先对药物敏感的寄生虫种群发生敏感性的遗传丢失过程，最终，抗性基因的积累导致有相当数量的虫体存活^[29-30]。

先天免疫作为宿主防御的前线，在识别和响应微生物衍生物、细胞因子、抗菌蛋白的产生以及建立物理化学屏障等方面发挥着关键作用。先天免疫始于一层肠上皮细胞 ( intestinal epithelial cell，IEC) 及其产物，它不仅构成肠道微生物的物理细胞屏障，而且构成由杯状细胞和潘氏细胞产生的抗菌蛋白组成的黏液化学屏障。IEC直接暴露于肠腔，表达模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs) 和G蛋白偶联受体 ( G－protein－coupled receptors，GPCRs) 来检测微生物产物。微生物刺激调节传统先天免疫细胞的活性，如巨噬细胞和先天淋巴细胞 (innate lymphoid cell，ILC)。微生物及其代谢物的异常变化和宿主先天免疫反应的调节密切相关。覆盖在肠上皮表面的化学屏障，功能上由抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP) 和黏液组成。研究表明，SCFAs增强了这2种屏障的成分。丁酸盐通过GPR43作用，在IEC 中诱导如RegIIIg和β防御素等AMP^[31]。丁酸不仅能诱导AMP的产生，还能增强黏液的形成，强化肠道屏障。SCFAs抑制组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase，HDAC)的一个靶点是IL－10R，而IL－10R可以改善黏膜损伤期间肠上皮的屏障功能^[32]。微生物发酵膳 食纤维生产的琥珀酸，由于其在代谢稳态和肠道微生物组与宿主免疫系统之间的相互作用，近年来备受关注。琥珀酸既可以作为三羧酸循环的中间体，也可以作为GPCR、SUCNR1受体配体。SUCNR1除了在上皮细胞中表达外，还在天然免疫细胞中表达，如巨噬细胞和树突状细胞 (dendritic cell，DC)^[33]，这表明琥珀酸在天然免疫信号传导中具有直接的调控作用。 微生物群衍生的芳香族氨基酸代谢物在调节先天免疫应答中发挥重要作用。色氨酸衍生的代谢物能通过I型干扰素信号调节对流感感染的先天免疫反应。而吲哚衍生物被认为是芳香烃受体 (aryl hydrocarbon receptor，AhR) 信号传导通路的关键配体，该通路在感染和炎症时协调先天免疫反应。次级胆汁酸如去氧胆酸盐和石胆酸盐被证明是感染和伤口愈合的重要免疫调节剂，可以直接影响先天免疫系统，增强宿主感染后的免疫防御。

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4.创新点与项目特色

（1）创新点

想法创新。国内目前暂无关于羊染病后体内Toll样受体的变化及其所发挥的作用的研究。TLR是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR为单个跨膜非催化性蛋白质，可识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障时，TLR可识别它们并激活机体产生免疫细胞应答，可起到监控作用。进行对染病山羊TLR变化规律研究，对捻转血矛线虫病的防治提供新思路。

（2）项目特色

在未对羊体解剖的情况下利用分离山羊PBMC方法检测其染病后体内TLR变化规律，为捻转血矛线虫病及其他感染病的防治提供新思路。

5.技术路线、拟解决的问题及预期成果

（1）技术路线：

（2）拟解决的问题

目前，有关捻转血矛线虫病免疫机制的宿主先天免疫应答在抗感染中的作用机制还不清楚。该研究有望探究捻转血矛线虫调节宿主免疫应答的相关规律，为深入了解虫体与宿主间相互作用提供新的数据支撑。

（3）预期成果

弄清捻转血矛线虫感染后山羊TOLL样受体的变化规律和特点，掌握宿主关键性TOLL样受体的种类。

6.项目研究进度安排

2022年1月-2022年2月：学习理论知识，查阅相关文献。

2022年3月-2022年6月：检测山羊Toll样受体（TLR）家族成员的转录水平动态变化。

2022年7月-2022年8月：中期总结。

2022年9月-2022年12月：检测山羊Toll样受体（TLR）家族成员的蛋白水平动态变化。

2023年1月-2023年2月：数据分析，过程反思，得出项目研究结果并撰写报告。

7.已有基础

本课题组在前期研究中发现捻转血矛线虫 ESP蛋白能与山羊 PBMC 中不同亚类细胞相结合。多年来，本实验室一直致力于捻转血矛线虫的研究，经验丰富，指导老师已经在相关研究领域取得了研究进展，具备本项目研究所需的分子生物学、细胞生物学、蛋白质功能的主要技术，本实验室具备本研究所需相关的仪器设备，可以满足实验的需要。同时本实验室已有各种实验试剂，具备稳定的试剂采购渠道，故本课题的全部实验研究均可在本实验室完成。