磷是植物生长发育所必须的元素，不仅是植物细胞的重要组成部分，在植物的各项生理活动中也扮演着极为重要的角色。因此，磷的缺乏会严重影响植物的生长发育以及作物产量。磷在土壤中的总量较为丰富，但植物所需的可溶性磷酸盐在土壤中含量很低，难以满足植物生长所需。世界上有大量农田面临着缺磷导致的诸多问题，“缺磷”已经极大地限制了现代农业的发展。上世纪我国部分地区曾采用大量施加有机磷的方式来解决磷含量不足的问题，但作物对于肥料磷的利用率不高，绝大多数的磷被土壤中的铁、铝氧化物固定，同时肥料磷大量流失至水体也造成了环境污染。因此，如何高效地为植物补充磷成为了现代农业发展的一大难题。

为更好地适应环境，植物进化出磷酸盐饥饿反应以应对低磷条件。植物磷酸盐饥饿反应主要通过两种途径增加磷的吸收，一是改变根系形态，二是调节自身生理反应。当土壤中磷含量不足时，植物根系形态发生适应性变化，具体表现为根半径减少、根冠比以及根比表面积显著提高^[1]。同时，植物增加有机酸的分泌以及提高根分泌酸性磷酸酶的活性，以此减小根际PH，应对低磷胁迫^[2]。

除了磷酸盐饥饿反应，植物还通过与某些微生物建立互利共生的关系来应对低磷环境。植物根系存在大量微生物定殖，一些其生活史的特定阶段或全部阶段寄生在植物组织内，且不对植物产生有害症状的一类真菌称为植物内生菌。内生真菌定殖对植物的免疫系统、病害抑制、营养获取和对非生物胁迫的耐受性等方面都起着积极的影响。

植物根系为根系微生物提供了包括根际和根内等生存环境。根系微生物群落的构建很大程度上受寄主植物的影响，大量研究表明，内生菌的种类、分布和定殖都因植物种类不同而异。目前对这方面的内容研究较为深入，已经证实植物主要通过根系分泌物和植物免疫系统调节根系微生物群。此外，植物的基因对于根系微生物的调控也具有一定的作用，由植物的基因型决定的根际效应、免疫系统、营养运输和对胁迫的反应调节着根系微生物结构，进而影响植物本身的生长和发育。

目前对于根系微生物和植物相互作用的研究已取得相当的进展，但对于微生物与微生物之间，特别是内生真菌对根内细菌的相互作用的研究较少。根据据现有的一些研究，微生物-微生物相互作用也参与了根微生物群落的组成，但具体的作用机制仍不明确。

AS42是从土壤中分离得到的一株曲霉真菌，可以稳定定殖于水稻根系，本项目正是以此为研究基础。通过测定解磷能力、吲哚乙酸生产能力、氮气固定能力和ACC脱氢酶活性等方面的测定探究内生细菌对植物生长的影响。再进行内生真菌和根际细菌的对峙培养和内生细菌在曲霉AS42的定殖研究等一些列研究以探究水稻根部内生细菌与曲霉AS42的互作效果和互作机制。为进一步揭示内生细菌和曲霉AS42的特性，本项目还将对内生细菌在水稻根部的定殖和内生细菌与曲霉AS42共同侵染水稻时对水稻表型影响展开研究。

1 水稻根部内生细菌的筛选和鉴定

培养无菌水稻苗，以是否接菌和不同磷浓度为主要因子，种子在培养基培养后，采集植物根系进行16s测序，对该数据进行alpha和beta分析，完成组间物种差异分析、组间群落差异分析以及环境因子分析。采用研磨匀浆涂布法分离内生细菌，并用平板划线法纯化。

2 水稻根部内生细菌与曲霉AS42互作效果的探究

  将根内细菌和AS42菌株分别活化并进行对峙实验，获得可以与真菌相互影响的菌株。使用植物基因组DNA试剂盒提取DNA，然后通过定量PCR（qPCR）检测这些样本的真菌定殖情况，并计算每个样品的真菌定殖指数。

3 水稻根部内生细菌对植物影响的探究

将根内细菌单独培养和根内细菌与AS42真菌共培养分别进行转录组测序，对二者转录组进行差异分析。测定其苗高、鲜重、干重、根鲜重和光合色素含量等生长指标并进行对比。

真菌和细菌的亲密相互作用在自然界中广泛存在。然而，菌丝相关细菌群落的选择及其在土壤系统中的功能性状的主要驱动因素仍不清楚。目前，对AM定殖的调控机制研究的较为透彻，但对于其他内生真菌，尤其是非菌根、非结瘤真菌定殖的调控机制的研究还鲜见报道。此外，植物根系为根系微生物提供了包括根际和根内等生存环境。有研究表明，寄主植物对根际、根内微生物群落构建的影响最大。但是，微生物—微生物之间相互协同和拮抗作用共同驱动微生物群落的分化，多样性和稳定性。值得一提的是，内生真菌与植物根系细菌相互作用的研究仍旧存在较大的空白。

本项目旨在通过利用已确定可稳定定殖于水稻根系的曲霉AS42，与水稻根部细菌互作来探究根内细菌与内生真菌的互作关系，解释其内在调控机制，从而研究其对水稻的影响。

1根内细菌与内生真菌的相互作用

目前对于微生物与微生物之间相互协同和拮抗共同驱动微生物群落的分化、多样性和稳定性的研究较少，内生真菌与植物根系细菌相互作用的研究依旧存在较大空白。本项目将筛得的根内细菌与AS42进行对峙培养试验，筛选出与AS42互作的根内细菌，并通过探究内生细菌对曲霉AS42解磷能力的影响和内生细菌对曲霉，以此探究根内细菌与内生细菌的相互作用。

2内在调控机制的探究

目前，对AM定殖的调控机制研究得较为透彻，但对于其他内生真菌，尤其是非菌根、非结瘤真菌定殖的调控机制的研究还鲜见报道。本项目进行内生细菌在水稻根部定殖情况以及内生细菌与曲霉AS42共同侵染水稻时对水稻表型影响进行研究，并结合根内细菌和曲霉AS42对峙培养实验，探究曲霉AS42定殖的内在调控机制。

1 技术路线

2 拟解决的问题

目前对于细菌和真菌互作作用的研究已经取得了相当的进展。已知微生物-微生物相互作用参与了根微生物群落的组装，但具有有益功能的真菌根微生物群成员如何影响和受细菌定植的影响仍不太清楚。本研究拟通过于磷缺乏土壤的种植，采集植物根系进行16s测序，对该数据进行alpha和beta分析，明确根内真菌定殖对根内细菌群落构成的影响。再通过内生细菌与曲霉AS42共同侵染水稻时对水稻表型影响，从而探究根内细菌与内生真菌的互作关系，解释其内在调控机制。

3 预期成果

1.内生真菌特异性招募的菌属。

2.根内细菌的功能和特性。

3.与内生真菌相互作用的菌株。

4.内在调控机制的探究。

5.完成结题报告1篇，发表文章1篇。

2022年12月~2023年1月：收集资料，进行技术和资料的累积；

2023年2月~2023年3月：进行前期植物材料，AS42菌种，土壤等材料准备

2023年4月~2023年5月：根内细菌的筛选与纯化

2023年6月~2023年7月：有效内生细菌的鉴定

2023年8月~2023年9月：内生细菌影响植物生长的特性探究

2023年10月~2023年11月：水稻根部内生细菌与曲霉AS42互作效果的探究

2023年12月~2024年1月：水稻根部内生细菌与曲霉AS42互作机制的探究

2024年2月~2024年3月：内生细菌在水稻根部定殖情况的探究

2024年4月~2024年5月：内生细菌在水稻根部定殖情况的探究

2024年6月：分析数据，撰写报告，准备结题。