生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。依据功能可以分为分为：抗菌肽及抗病毒肽、神经肽、激素调节肽、免疫活性肽等。小分子肽比单一蛋白质更易吸收，吸收率和利用程度高，微量就可发挥强大的生理活性，比游离氨基酸更具生物效价和营养价值。

我国是鸭养殖大国，出栏量和消费量居世界第一，每年肉鸭加工过程中产生的禽血每年达5000多吨。鸭血具有高蛋白低脂肪，营养丰富的优点。虽然鸭血来源广泛、营养丰富，但是深加工程度低。由于全血中含有大量的血细胞，在加工中易造成产品颜色发黑、适口性差，在生产过程中工序繁琐，因此应用受到限制。

通过超声辅助酶解工艺，探究更适合制备生物活性肽的蛋白酶和超声条件。充分利用充足的养殖鸭资源，实现鸭加工副产物的高价值利用，节约资源，保护环境，本课题有较强的现实意义。

（1）以番鸭血细胞为酶解底物，考虑酶解产物对革兰氏G+和G-细菌的抑菌率，确定酶解番鸭血细胞抑菌肽的最适蛋白酶。

（2）为确定超声辅助酶解制备抑菌肽的最优工艺，采用单因素试验分析超声功率、酶解时间和加酶量对番鸭血细胞抑菌肽活性的影响。

（3）在单因素试验基础上，采用响应面法分析超声功率、酶解时间和加酶量对番鸭血细胞抑菌肽活性的影响。

（1）生物活性肽研究进展

A、抗菌肽

现今，随着细菌耐药性的增强，人们对新型抗菌肽的需求量日益增加，食源性抗菌肽倍受关注，抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000-7000左右，由20-60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，可以快速查杀靶标，并且其中很多是纯天然的肽，这使它迅速成为潜在的治疗药物。抗菌肽的治疗范围为:革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等。1981年,Stiner H等^[1]发现天蚕蛹的抗菌物质Cecropins,它在昆虫的天然免疫中起重要作用,被称作为抗菌肽。迄今为止,几百种抗菌肽已经被不断发现，它们来源各异、用途广泛。

国内研究学者江晨等^[2]以低温冷榨花生蛋白粉为原料，以蛋白酶解得到的抗菌肽复合物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和米曲霉抑菌率为考察指标，在单因素试验与响应面试验设计结合，得到超声波辅助酶解制备花生抗菌肽的最优工艺参数，为花生抗菌肽的分离、纯化及应用等提供了理论基础。阳离子抗菌肽在防止食品腐败方面颇有效用，Um Jounghyun Journal等人^[3]利用含不同比例阴离子果胶/海藻酸盐的凝胶来富集牛奶水解液中的阳离子抗菌肽，发现果胶∶海藻酸凝胶比例为60∶40时保留的多肽抑菌作用较强。实验结果显示果胶/海藻酸盐食品凝胶在分离富集复杂食品蛋白酶解产物抗菌肽时有安全、快速、经济的特性。抗菌肽Leg1（RIKTVTSFDLPALRFLKL）对腐败细菌、酵母和霉菌具有活性。Heymich MarieLouise等人^[4]研究测试了鹰嘴豆素中的Leg1在食品储存条件下的有效性。Leg1在20℃或4℃条件下，对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC 62.5 M）在7天内保持稳定。pH降低(5.0 vs. 6.8)对其无影响。Leg1的功效相当于nisin，比苯甲酸钠、山梨酸钾、亚硝酸钠的活性高5000- 82000倍。用更天然的替代品醋酸盐或氯盐取代肽合成的反离子三氟乙酸盐并不损害Leg1的活性。结果表明，食品级Leg1可能适用于食品保鲜。

B、ACE抑制肽

血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)是由单一肽链组成的糖蛋白，属于外肽酶，是含锌元素的羧基肽酶，通过将血管紧张素I转化成血管紧张素Ⅱ来提高血压。血管紧张素转化酶抑制肽（Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides, ACEI）是通过抑制血管紧张素Ⅱ的合成或促进缓激肽的释放，抑制ACE活性从而降低血压。蛇毒是人类最初认识天然血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的来源。

当前，中国已经有学者对食品源ACE抑制肽进行了一些研究，辛志宏^[5]等人用8种蛋白酶分别对小麦麦胚蛋白进行单一酶和复合酶水解制备ACE活性肽，通过HPLC的活性测定发现，碱性蛋白酶生产水解物的活性最大，在最适pH为9，温度50-55℃，加酶量为24 Au/Kg，水解度为16.5%时得到活性最高的ACE抑制肽。2004年，张国胜^[6]等人以大豆分离蛋白为原料，选用四种商业蛋白酶水解获得大豆蛋白ACE抑制肽，并以水解度为指标设计正交实验得出，在pH值为8.0，温度为45℃，酶与底物浓度比为6%时，水解480 min得到的ACE抑制肽活性最强。国外了解ACE领域比国内要早。早在1965年，Ferreira就从南美洲茅头蝮蛇（Bothrops jararaca）蛇毒中发现的多种舒缓激肽增强肽（Bradykinin Potentiating Peptide，简称BPP），是最早发现的天然血管紧张素转化酶抑制肽。1979年，Oshima^[7]等获得了6种活性较强的ACE抑制肽，这是人类首次利用食物蛋白质水解得到的食源性ACE抑制肽。随后，大量的ACE抑制肽相继从不同的食物蛋白中得到，开始了人类认识并利用ACE抑制肽的新纪元。如今已有许多外国学者对食源性ACE抑制肽进行了研究，Kaprasob Ratchadaporn等^[8]研究了白灵菇水解产物新活性肽的降压活性，Abedin Md Minhajul等^[9]研究喜马拉雅地区牦牛和牛乳硬质酸奶酪ACE抑制肽和抗氧化肽的特性，这些研究都有利于实现食品的高值利用。迄今为止，日本是研究ACE抑制肽最多的国家，主要是从乳源蛋白质中提取，其次是鱼蛋白、玉米蛋白和大豆蛋白等，其中已有部分产品实现工业化生产，将ACE抑制肽制成药片、口服液或作为功能因子添加到各种食品中，取得了良好的经济效益和社会效益。

C、抗氧化肽

抗氧化肽是指能减轻人体过氧化反反应，中和自由基的肽类，通常把具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效的生物活性肽称为抗氧化肽，是公认的抗衰老物质。抗氧化肽分为生物体内的天然抗氧化肽和蛋白酶水解的抗氧化肽。蛋白酶水解的抗氧化肽包括植物源抗氧化肽和动物源抗氧化肽^[10]。

天然抗氧化肽主要包括肌肽和谷胱甘肽。1900年在俄国首次发现肌肽，它是一种水溶性天然二肽，由β-丙氨酸和L-组氨酸结合成β-Ala-His形式，并广泛存在于动物的骨骼肌中。以英国红芸豆为原料，研究得最佳酶解条件为底物浓度5.0%，温度55℃，加酶量4000 u/mL，pH为10，时间2 h，该条件下总抗氧化能力高达186.97 U/mg pro，英国红芸豆活性肽显示出较强得抗氧化活性^[11]。荣建华^[12]等通过实验测定发现，大豆肽具有较强抗氧化作用，其抗氧化值是维生素C的1.5倍。我国拥有丰富的各类蛋白质资源，生物活性肽的深入研究可提高其经济附加值，具有极大的经济效益，因此极具开发前景。国外正在研究从肉品屠宰下脚料中提取，以获得廉价而大量肌肽。谷胱甘肽是一种含巯基三肽，广泛分布于动植物细胞、谷物和油料种子中，在机体生化防御体系中起着重要作用。1888年Derey Pailhade首次从酵母中分离出天然型谷胱甘肽（GSH），1921年Hopkins第一次制备GSH结晶，1929年Pirie和Pinher通过对该三胎生理化学研究，得到了GSH正确结构式，1935年首次人工合成GSH。Ramos等用四种商业酶（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）和三种粗蛋白酶（A-地衣芽孢杆菌内源酶、B-芽孢杆菌蛋白酶、C-曲霉內源酶和外肽酶）水解乳清分离蛋白，得到水解度在4%-37%范围内乳清蛋白水解肽，其中粗蛋白酶F在50℃作用6h（乳清蛋白溶液经90℃，5min预热），得到水解度最高乳清蛋白酶。^[13]

（2）超声辅助酶解法

目前，制备生物活性肽的方法有很多，超声辅助酶解法是此次实验的主要方法。而超声波是一种波长极短的机械波，可用于清洗、碎石、杀菌消毒等。在国内到80年代药检部门利用现有的超声清洗设备进行了植物药材的提取实验。进入21世纪，超声提取不但在中草药材成分提取方面广泛应用，而且已渗透到了需要提取物质内含物和提取分离无细胞组织的活性成分的各个领域^[14]。吉林农业大学的殷海洋^[15]用超声波辅助酶法制备油莎豆ACE抑制肽,山东农业大学许新月^[16]用超声辅助酶法制备杏鲍菇降血压活性多肽，超声波辅助技术已经展现出了广阔的应用前景，正在飞速发展。在20世纪50年代，国外就有人用超声作用于植物，提取出生物碱。1961年Bose等^[17]比较超声辅助和单一溶剂浸提两种方法从罗芙木属植物的根中提取生物碱，几乎相等的提取率, 超声波提取法只需15 min，而溶剂浸提法则需要8 h。Dem等^[18]利用超声波提取技术从曼陀罗叶中提取曼陀罗碱，用超声波提取30 min比用常规煎煮法提取3 h的样品含碱量高9%。由此看出，超声波辅助提取技术具有提高提取效率，优化实验的优势，对本实验大有裨益。

参考文献：

[1]Stiner H,Hltmark D,Engstrom A.Seguence and sepeciticity of two antibacterial proteins in sect immunity[J].Nature,1981,292(5820):246-248.

[2]江晨.齐宏涛.于丽娜.彭娅萍.杨伟强.毕洁.王明清.孙杰.宋昱.响应面优化花生蛋白抗菌肽制备工艺[J].山东农业科学. 2021,53(11)

[3]Um Jounghyun Journal[J].Food ChemistryVolume 352, 2021. PP 129220-129220.

[4]Heymich MarieLouise; Srirangan Showmika; Pischetsrieder Monika[J].FoodsVolume 10, Issue 6. 2021. PP 1192-1192.

[5]辛志宏,吴守一,马乐海等.从麦胚蛋白质中制备抗血压肽的研究[J].食品科学,2003,24(10):120-123.

[6]张国胜,孔繁东,祖国仁等.大豆蛋白抗高血压活性肽的研究[J].中国乳品工业.2004,3(28):12-14.

[7]Oshima G, Shimabukuro H, Nagasawa K．Peptide inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme in digests of gelatin by bacterial collagenase[J]. Biochem Biophys Acta, 1979, 566:128-137．

[8]Kaprasob Ratchadaporn, Khongdetch Jindaporn, Laohakunjit Natta, Selamassakul Orrapun, Kaisangsri Nattapon. Isolation and characterization, antioxidant, and antihypertensive activity of novel bioactive peptides derived from hydrolysis of King Boletus mushroom[J]. LWT - Food Science and TechnologyVolume 160, 2022.

[9]Abedin Md Minhajul, Chourasia Rounak, Chiring Phukon Loreni, Singh Sudhir P, Kumar Rai Amit. Characterization of ACE inhibitory and antioxidant peptides in yak and cow milk hard chhurpi cheese of the Sikkim Himalayan region[J]. Food Chemistry: XVolume 13, 2022.

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[11]曲柳青.崔素萍.英国红芸豆蛋白抗氧化肽的分离纯化及体外活性研究[J].中国食品学报.2018.

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[15]殷海洋.超声波辅助酶法制备油莎豆ACE抑制肽及其抗氧化性研究[D].硕士学位论文，吉林农业大学，2021.

[16]许新月.超声辅助酶法制备杏鲍菇降血压活性多肽工艺优化[D].硕士学位论文,山东农业大学，2020.

[17]BOSE P C, SEN T C.Ultrasonic extraction of alkaloids from rauvolfia serpentina roots[J].Indian J Pharm, 1961, 23 (8) :222-223.

[18]DEM A E, LOTT J A.Application of ultrasound for increasing alkaloid yield from Datura stramonium Linn[J].J Pharm Sci, 1964, 53 (8) :945-946.

(1)原料采用番鸭血细胞。番鸭是优良的肉用鸭，肉质好、脂肪少，蛋白质含量高且养殖量大，素被视为补壮身体的珍品，深受到消费者的喜爱，但其加工副产物鸭血却浪费严重。鸭血富含蛋白质、铁元素及多种氨基酸，是营养价值很高的生物资源。采用番鸭血做为原料可以有效节约资源、实现番鸭血的高价值利用。

(2)使用超声辅助酶解工艺。超声辅酶提取法提取率高、提取时间短、产品纯度高、操作工艺简单、设备维护和保养方便、是一种实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段。通过超声辅助，可以有效提高酶解制备生物活性肽的效率。

项目技术路线图如图1:

                           图1 项目技术路线图

拟解决的问题

(1)最适蛋白酶的选择

(2)最佳超声辅助酶解工艺

实验方案：

（1）常规理化指标的测定

水分含量的测定根据《食品中水分的测定》（GB/T5009.3-2010），采用直接干燥法；总蛋白质含量的测定根据《食品中蛋白质的测定》（GB/T5009.5-2010），利用全自动凯氏定氮仪测定。

（2）游离氨基酸的测定  

取粗肽液5 mL，加入10 g/L的磺基水杨酸2 mL，10 g/L的EDTANa₂ 1 mL，超声1 h，静置放置过夜。将溶液转移至25 mL比色管中并用去离子水定容。摇匀，取2 mL稀释溶液并氮吹吹干，用2 mL 0.02 M稀盐酸溶解，再用0.22 μm水相微孔滤膜过滤，取20 μL用氨基酸自动分析仪Hitachi L-8900A进行游离氨基酸的测定。

（3）水解度的测定

水解度的测定方法参考Church^[1]等的方法并稍加修改。配置OPA反应液（避光）：25 mL 100 mmol/L硼砂，2.5 mL 20%（w/w）SDS，100 μL β-巯基乙醇，40 mg邻苯二甲醛溶于0.5 mL甲醇（避光），去离子水定容至50 mL。取15 μL样品和200 μL OPA反应液混合室温避光2 min，在340 nm处测量吸光值。配置0-1 mg/mL胰酪蛋白胨作为标品。

（4）蛋白酶的选择

调节底物浓度为80 mg/mL，调节pH至最佳，恒温保持10 min后，分别加入4000 U/g的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，分别在其最适pH和温度下反应0、2、4、6、8、10 h。各蛋白酶最适反应条件为：碱性蛋白酶65℃，pH=10；木瓜蛋白酶55℃，pH=6.5；胃蛋白酶37℃，pH=2。

由以上试验结果，找出最适宜的蛋白酶作为制备番鸭血细胞抑菌肽单因素试验最适蛋白酶。

（5）抑菌活性的测定

采用微孔稀释法^[2]检测多肽的抑菌活性。通过检测 562nm处的吸光度来测定多肽的浓度。选择对数期生长期的菌种，吸取100μL的LB培养基添加到平底的无菌 96 孔板中。肽溶液通过 0.22μm水膜过滤、消毒、吸取100μL再次加入到无菌96孔板中。未添加菌种的LB培养基为空白，含有菌种且不加抗菌肽的培养基为阳性对照。37℃培养12-16h，在600nm条件下用酶标仪测量吸光度。抑制率计算公式如下：

抑制率（％）= [1-(A₁-A₀)/（A₂-A₀）]×100

式中：A₀、A₁和A₂分别代表空白组、样品和对照组的 OD₆₀₀值。

（6）抗氧化活性的测定

DPPH 自由基清除率按照You等^[3]的方法测定。将样品与等体积的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液混合。使用涡旋仪振荡均匀混合物，并在室温避光孵育 30 min。然后用酶标仪测定517 nm处的吸光度。对照组为无水乙醇和等量的0.2 mmol/L DPPH。DPPH自由基清除率的计算公式为：

DPPH自由基清除率（％）= (1-A_sample/A_control)×100

（7）体外ACE抑制活性测定

多肽液的体外ACE抑制活性的测定参考Cushman和Cheung^[4]等的方法并稍加修改。配制0.1 mol/L硼酸盐缓冲液（pH=8.3，含有0.3 mol/L NaCl），用硼酸盐缓冲液分别配制5 mmol/L HHL溶液、0.1 U/mL ACE 和1 mg/mL样品。将200 μL HHL和80 μL样品混合于2 mL离心管中，37℃水浴10 min，加入20 μL ACE，在37℃水浴条件下反应1 h，加入150 μL 1 mol/L HCl终止反应。反应液过0.22 μm水系滤膜进行HPLC上样分析。用硼酸盐缓冲液代替样品作为空白对照。

高效液相色谱分析的条件：色谱柱：C18 液相色谱柱（φ4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温30℃；进样量：10 μL；检测器：PDA检测器；检测波长：228 nm；流速1 mL/min；洗脱时间：15 min；洗脱程序：85%洗脱液A（超纯水，含0.1%甲酸及三乙胺），15%洗脱液B（乙腈，含0.1%甲酸及三乙胺），等度洗脱。

样品对ACE抑制活性计算公式如下：

式中：A_blank代表空白对照组生成的马尿酸峰面积；A_sample代表样品组生成的马尿酸峰面积。

（8）番鸭血细胞蛋白酶解液的制备

新鲜番鸭血在4℃条件下由屠宰场运到实验室，立即在转速10000g、温度4°C下离心10min后，将上清液和沉淀分装冻存在-20℃保存。

将番鸭血细胞置于室温下流水解冻后，对其进行超声细胞破碎，静置30min，在转速10000g、温度4°C下离心10min，收集上清液，对其进行冷冻干燥处理，在-20℃条件下保存备用。按10％血粉溶解在去离子水中，取50mL置于烧杯中，然后用1mol/L HCl或NaOH调节pH至各蛋白酶最适pH，置于水浴锅中水浴保持10min，添加蛋白酶，恒温搅拌水解。酶解过程中每隔30min调节酶解液pH至最佳pH。取样后，调节pH至7，置于沸水浴中灭酶10min，冷却至室温后进行离心（12000g，10min，4℃），取上清液冷冻干燥，保存于-20℃备用。

（9）超声辅助酶解处理条件的单因素实验

单因素试验初始条件为：超声功率200W、酶解时间4h、酶解温度65℃、pH=10、加酶量4000 U/g。分别选取超声功率（100、150、200、250、300W）、酶解时间（0、2、4、6、8h）、加酶量（2000、3000、4000、5000、6000U/g）进行试验，每组试验改变一个因素，其他因素保持初始水平。

1）超声功率对番鸭血细胞抑菌肽抑菌活性的影响

超声功率设置为100、150、200、250、300 W，酶解温度65℃、酶解时间4 h、pH=10、加酶量4000 U/g，酶解反应结束后，离心取上清液，测定其水解度和抑菌活性。

2）酶解时间对番鸭血细胞抑菌肽抑菌活性的影响  

酶解时间设置为0、2、4、6、8h，酶解温度65℃、pH=10、加酶量4000 U/g、超声功率200W，酶解反应结束后，离心取上清液，测定其水解度和抑菌活性。

3）加酶量对番鸭血细胞抑菌肽抑菌活性的影响

加酶量设置为2000、3000、4000、5000、6000U/g，酶解温度65℃、酶解时间4 h、pH=10、超声功率200W，酶解反应结束后，离心取上清液，测定其水解度和抑菌活性。

（10）响应面优化试验

在单因素试验基础上，以抑菌活性（Y）作为唯一的响应值，选取超声功率（X₁）、酶解时间（X₂）、加酶量（X₃）三个因素，进行Box-Behnken响应面优化试验设计，并建立合适的回归模型方程，最终确定超声辅助酶解番鸭血细胞制备抑菌肽的最佳工艺参数。

预期成果

（1）确定酶解番鸭血细胞制备抗菌肽的最适蛋白酶。

（2）通过单因素和响应面优化实验，测定水解度和抑菌率，确定超声辅助酶解制备生物活性肽的最优工艺，提高鸭血资源的高值化利用。

（3）按照项目计划展开实验研究，并提交《项目中期检测表》等阶段性研究报告。

（4）撰写研究报告1分、发表相关论文1篇。

(1)2022年4月至2022年5月通过测定其水解度和抑菌活性，找到最适宜酶解番鸭血细胞的蛋白酶。

(2)2022年5月至2022年7月找到最适宜的超声处理方式，并对超声条件进行单因素实验。

(3)2022年7月至2022年8月对于单因素得出的结果进行响应面优化，获得最佳的超声酶解工艺。