以我国重要淡水草食性经济鱼类——团头鲂为研究对象，通过在日粮中添加适宜浓度的磷脂酰丝氨酸（PS），考察鱼体生长性能、应激反应、免疫机能和抗病力的变化，初步明确磷脂酰丝氨酸是否可以通过降低血浆皮质醇含量缓解高密度养殖鱼类的应激反应并改善其免疫机能。

实验日粮及养殖试验

本试验采用双因素设计中的2×2设计，分别以养殖密度和磷脂酰丝氨酸水平为考察因素。其中，养殖密度分别为20与60 尾/m³（正常与高密度），日粮磷脂酰丝氨酸水平分别为0与50 mg/kg（对照与有效剂量）。团头鲂养殖密度参照已有文献确定，而磷脂酰丝氨酸剂量经换算得出。经查阅资料，国家卫生部推荐的人的磷脂酰丝氨酸摄入量为5 mg/kg体重。假设实验鱼体重20 g，日摄食率为10%。考虑到二者体重因素，实验日粮中磷脂酰丝氨酸的有效剂量约为50 mg/kg。实验日粮以鱼粉、豆粕、菜粕和棉粕为蛋白源，以鱼油和豆油为脂肪源，以玉米淀粉为糖源。基础日粮的配方如表1所示。

试验所需团头鲂幼鱼取自湖北省鄂州市国家团头鲂原种场。试验前，将团头鲂幼鱼暂养两周，以使其适应养殖环境。期间，投喂商品饲料(其蛋白和脂肪含量分别为32%和5%)。暂养结束后，随机选取体重约20 g的幼鱼若干尾，将其随机分为4组，分别为：正常密度+对照日粮组、正常密度+磷脂酰丝氨酸日粮组、高密度+对照日粮组与高密度+磷脂酰丝氨酸日粮组。养殖试验在室内循环水族箱中进行，养殖周期为12周。期间，每天饱食投喂三次(07：30，11：30和16：30 h)。全程采用微流水循环(1.5L/min)，水温保持在27±1 ℃，溶解氧为5.0 mg/L以上，总氨氮和亚硝酸盐分别控制在0.2和0.01 mg/L以下，pH为7.0-7.5。

表1基础日粮配方

Table 1 Formulation of the basal diet

¹ 复合预混料提供以下矿物质和维生素 (每公斤):CuSO₄·5H₂O,2.0克；FeSO₄·7H₂O,25克;ZnSO₄·7H₂O,22克;MnSO₄·4H₂O，7克;Na₂SeO₃,0.04克;KI，0.026克；CoCl₂·6H₂O,0.1克;维生素A,900000IU;维生素D,200000IU;维生素E,4500毫克;维生素K₃,220毫克;维生素B₁,320毫克;维生B₂,1090毫克;维生素B₅,2000毫克;维生素B₆,500毫克;维生素B₁₂,1.6毫克;维生素C,5000毫克;泛酸盐,1000毫克;叶酸，165毫克;胆碱,60000毫克；肌醇，15000毫克。按差值计算无氮浸出物(100-水分-粗蛋白-粗脂肪-灰分-粗纤维)。

¹Compound-premix supplied the following minerals and vitamins(per kg): CuSO₄?5H₂O, 2.0 g; FeSO₄?7H₂O,25 g; ZnSO₄?7H₂O, 22 g; MnSO₄?4H₂O, 7 g; Na₂SeO₃, 0.04g; KI, 0.026 g;CoCl₂?6H₂O, 0.1 g; Vitamin A, 900,000 IU; Vitamin D, 200,000 IU; Vitamin E,4500 mg; Vitamin K₃, 220 mg; Vitamin B₁, 320 mg; Vitamin B₂, 1090 mg; VitaminB₅, 2000 mg; Vitamin B₆, 500 mg; Vitamin B₁₂, 1.6 mg; Vitamin C, 5000 mg; pantothenate, 1,000 mg; folic acid, 165 mg; choline, 60,000 mg；inositol，15，000 mg.Calculating the Nitrogen-free extract by difference (100 - moisture - crude protein - crude lipid - ash – crude fiber).

样品采集

养殖试验结束后，将鱼禁食24 h以清空肠道内容物。用浓度为100 mg/L的MS-222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Sigma，美国）麻醉。清点水箱中鱼的尾数，并称重。每个水箱随机选取4尾鱼，记录体重和长度后于冰袋上通过尾静脉抽血，取得血样立即放入抗凝管（肝素钠处理）中，于3500 r/min、4 ℃下离心10 min。吸取上清液，存放于-80℃冰箱中备用。随后，将鱼解剖，在冰袋上迅速分离出肝脏并称重，分装好后存入-80 ℃冰箱保存。最后，每个水箱随机取2尾鱼存入-20 ℃冰箱冷冻保存，作为体组成分析备用。

生长性能分析

测量并统计养殖周期内团头鲂的初重、末重、成活率、增重率、特定生长率、肝体比、氮保留率、能量保留率、饲料系数、蛋白质效率、肥满度、摄食率等指标。部分指标计算公式如下：

采食量(g)=总采食量(g)/鱼的总数

初始体重IW(g)=W0;

终末体重FW（g）=Wt;

成活率SR（%）=100×终尾数/初尾数；

增重率WGR（%）=100×[(Wt-W0)/W0];

特定生长率SGR（%/d）=100×[(ln Wt-ln W0)/T];

肝体比HSI(%)=100×肝重（g）/全鱼重(g);

氮保留率NRE(%)=100×(Wt×Nt-W0×N0)/(Ndiet×采食量);

能量保留率ERE（%）=100×(Wt×Et-W0×E0)/(Ediet×采食量);

饲料系数FCR=采食量/(Wt-W0);

蛋白质效率PER==（Wt-W0）/蛋白质摄入量（g）;

肥满度CF=100×Wt/L³；

摄食率FI（g）= 100×采食量/［T×(W0+Wt)/2］。

T是试验天数（d），L是鱼体长度（cm），N0/E0和Nt/Et分别表示全鱼开始和养殖结束后氮和能量的含量，Ndiet/Ediet表示饲料中氮和能量的含量。

饲料与鱼体概略养分分析

饲料以及鱼体的水分含量通过在105℃烘箱中恒温干燥失重后测定；粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定（总氮×6.25），仪器为凯氏定氮仪(FOSS KT260，瑞士)；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定：以乙醚为提取剂，仪器为SoxtecSystemHT（Soxtec SystemHT6，Tecator，瑞典）；粗灰分含量采用马福炉灰化法测定：样品置于坩埚中并于电炉上碳化，置于马福炉中于550±20 ℃下灼烧4 h后确定粗灰分含量；粗纤维测定：将样品进行酸碱处理后，采用粗纤维分析仪(ANKOM A2000i，美国)进行分析；使用氧弹测热仪（PARR 1281，美国）测定总能。

肝脏抗氧化指标测定

将肝组织样本在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重。放入5或10 ml的离心管内，按1:9倍质量体积比加入0.86%生理盐水。在冰水浴中，使用高速匀浆机匀浆，直至离心管中无明显块状物。匀浆完成后，4 ℃下于3000 r/min转速离心15 min，取上清液备用。

取用肝脏离心上清液进行抗氧化相关指标测定。其中，丙二醛（MDA）含量使用硫代巴比妥比色法测定；总超氧化物歧化酶（SOD）活性使用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化氢酶（CAT）活性使用过氧化氢还原法测定；谷胱甘肽还原酶（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性使用酶偶联连续监测法测定。以上试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

血浆应激指标的测定

取用血样离心上清液用于应激及肝损伤相关指标的测定。其中，乳酸（LD）含量采用比色法测定；血浆谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）活性采用紫外比色法测定。上述指标测定均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，具体操作步骤参照试剂盒说明书。血糖（GLU）含量采用葡萄糖氧化酶法测定，使用上海榕柏生物技术有限公司所生产的试剂盒检测；血浆皮质醇含量送样到江苏泽雨生物科技有限公司采用双抗体夹心ELISA法测定。

血浆非特异性免疫指标测定

取用血样离心上清液。血浆溶菌酶（LYZ）活性采用比浊法测定；血浆免疫球蛋白M（IgM）、补体C3和C4含量均采用酶联免疫法测定；总蛋白（TP）与白蛋白（ALB）含量分别采用双缩脲法和溴甲酚绿法测定；髓过氧化物酶（MPO）活性采用邻联茴香胺进行比色法测定；酸性磷酸酶（ACP）活性采用磷酸苯二钠进行微板法测定。上述指标测定均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，具体操作步骤参照试剂盒说明书。球蛋白含量通过总蛋白减去白蛋白含量计算而得。

嗜水气单胞菌攻毒试验

嗜水气单胞菌（A.hydrophila，XY-16）由南京农业大学动物医学院提供。其活化步骤如下：在无菌条件下，取–80 ℃保存菌种划线接种于琼脂固体平板培养基上。在恒温箱内28 ℃培养20 h后挑取单独菌落，并接种于5 mL肉汤液体培养基中，28 ℃摇床恒温过夜培养(180 r/min)。

在正式攻毒试验之前，通过预试验确定半数致死剂量LD50。使用肉汤液体培养基将菌液按10倍系列浓度进行稀释（1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷，1×10⁸，1×10⁹与1×10¹⁰）后，在团头鲂腹部注射不同浓度梯度的嗜水气单胞菌，于96小时确定累计死亡率，进而确定半数致死浓度。

初次采样（统一生长性能数据和采集血液与肝脏等样品）1周后，将各组剩余试验鱼平均分配于若干水缸中。用医用注射器腹腔注射半数致死剂量的嗜水气单胞菌，在接下来的96小时内统计累计死亡率。

数据的统计与分析

所有试验数据均采用SPSS 20.0软件进行统计分析。其中，生长性能、肝脏抗氧化、血浆应激和非特异性免疫指标数据分别以养殖密度、磷脂酰丝氨酸剂量和两者的交互作用为影响因素进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)；攻毒试验数据以攻毒时间、实验处理和两者的交互作用为影响因素。交互作用显著时，采用Turkey’s检验法进行多重比较，显著性水平为P<0.05，所有数据采用平均值±标准误差(Mean±S.E.M)表示。

团头鲂是我国重要的淡水草食性鱼类，其肉质鲜嫩美味，抗病力强，具有较高的营养价值和经济价值。目前，随着集约化养殖模式的普及，养殖户多以高密度模式养殖团头鲂，以获得更高的产量和养殖效益。然而，团头鲂生性敏感，易在高密度条件下产生应激反应，具体表现为摄食量下降、免疫力降低和体表应激性出血等。这极不利于成品鱼的大规模生产，更会造成抗病力降低和产品质量下降等问题，最终导致养殖户经济损失。因此，如何缓解高密度养殖条件下团头鲂应激反应并增强其免疫机能和抗病力成为水产生产上亟待解决的问题。

目前，有关团头鲂抗高密度应激及其营养调控技术的研究相对缺乏。仅有的几篇研究表明，在饲料中添加大黄提取物^[1]和微囊丁酸钠^[2]可分别提高鱼体抗氧化机能和肠道黏膜生长，进而改善其免疫机能。然而，相关研究大都局限于广谱性免疫增强剂和抗逆型饲料添加剂的研发，通过靶向降低皮质醇水平从而降低其应激反应和改善其免疫机能的研究尚未见报道。

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS），又称丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸或复合神经酸^[3]，是构成生物细胞膜内层的活性物质。研究表明，磷酯酰丝氨酸主要存在于大脑细胞中，且与一系列膜活动和大脑功能有关。例如，其可以1）修复受损神经细胞膜，增强神经生长因子活性，提高大脑认知能力，从而预防和治疗阿尔茨海默病^[4]；2）改变神经细胞膜的流动性，增加乙酰胆碱的合成，从而改善儿童多动症^[5]；3）降低生物体应激激素皮质醇水平，缓解大脑疲劳和精神压力^[6]。进一步的机理研究揭示，磷脂酰丝氨酸兼具水溶性和脂溶性特征，可影响细胞膜的流动性和通透性，并可修复受损细胞膜。此外，其可与磷脂酰胆碱（卵磷脂）、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）等磷脂类化合物互相转化，活化已损伤的表面凝血酶原、舒缓血管平滑肌，转变成乙酰胆碱以调节神经脉冲传导，作为细胞信号转导系统的组分激活各种酶类的代谢与合成。目前，磷脂酰丝氨酸已作为营养补充剂，被广泛应用于各类食品、药品及保健品中，用于帮助睡眠、改善记忆力和缓解不良情绪等^[7]。然而，其在水产动物上的相关研究尚为空白。其是否可以降低高密度养殖团头鲂皮质醇水平，进而缓解其应激反应并提高其免疫机能和抗病力尚不明确。

[1] 杨震飞.池塘跑道式养殖系统下密度应激对团头鲂生长、Nrf2通路的影响及大黄提取物的调控研究[D].南京：南京农业大学，2021：08；

[2] 罗玲，易德玮，杨坤明，韩奇鹏，曲湘勇.饲料中添加微囊丁酸钠对高密度养殖条件下团头鲂生长性能、非特异免疫力及肝功能的影响[J].动物营养学报.2018，30（7）；

[3]王小宾，张秉华，杨树民，等.HPLC-ELSD测定磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱含量的方法研究[J].西北药学杂志.2018，33（3）；

[4]Crook T，Petrie W，Wells C，et al. Effects of phosphatidylserine in Alzheimer’s disease[J].Psychopharmacology Bulletin，1992， 28（1）;

[5] Kidd PM. Attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) in children: rationale for its integrative management.[J].alternative medicine review a journal of clinical therapeutic.2000,5(5);

[6] Hellhammer J，Fries E，Buss C，et al. Effects of soy lecithin phosphatidic acid and phosphatidylserine complex（PAS）on the endocrine and psychological responses to mental stress[J].Stress：Amsterdam，Netherlands.2004，7（2）；

[7]童观珍，梁丽敏，金昱龙.磷脂酰丝氨酸的生物活性及其应用现状[J].中国食品添加剂.2021(4)；

目前，水产养殖集约化程度日益升高。在这种条件下，高密度养殖成为了提高养殖产量和养殖效益的不二选择。然而，过高的养殖密度会使鱼体产生拥挤胁迫，造成其应激反应并最终降低其免疫机能和抗病力。研究表明，鱼体应激反应主要由皮质醇大量分泌导致。然而，目前的相关研究大都局限于广谱性免疫增强剂和抗逆型饲料添加剂的研发，尚无靶向降低机体皮质醇营养调控物的研究。

本项目选取生产上采用高密度养殖模式且极易产生应激反应的团头鲂为研究对象，拟通过养殖试验和生物化学、生物统计学等手段，明确日粮中添加磷脂酰丝氨酸是否有助于降低高密度养殖下团头鲂的应激反应，进而提高其非特异性免疫机能和抗病力，从而为鱼体应激反应缓解机制及其营养调控技术研究提供理论指导，并为渔用抗应激剂的研发提供科学依据。

技术路线

拟解决的问题

高密度养殖下团头鲂应激缓解及免疫机能调控。

预期结果

①初步明确磷脂酰丝氨酸缓解高密度养殖团头鲂应激反应的效果，并阐明其对非特异性免疫机能与抗病力的调控作用；

②完成研究报告1份，并在核心刊物上发表论文1篇；

③小组成员的科研思维能力、实验操作能力和论文书写能力均得到提高，为未来的研究生学习打下坚实的基础。

项目研究计划

本项目小组于2022年2月与指导教师商讨后确定了研究主题，并依据项目研究内容的需求，查阅了国内外的相关资料。了解了团头鲂高密度养殖现状和产业中尚待解决的问题，并以此为基础确定了研究方向和内容。

在本学期，我们小组计划做好进入实验室开展相关研究的前期准备。等条件具备后，将在导师的指导下，进一步丰富任务申请书，为项目的顺利实施奠定基础。

进度安排

2022年2月—2022年3月：查阅文献，确立课题内容，完善试验计划；

2022年4月—2022年5月：申请项目，熟悉基本的实验操作；

2022年6月—2022年8月：进行养殖试验和样品采集工作；

2022年9月—2023年1月：进行生长性能、应激、抗氧化和非特异性免疫指标的测定分析；

2023年1月—2023年5月：进行数据分析，整理试验数据，撰写试验报告结题。